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人白介素1試劑盒IL-1α ELISA kit
更新時(shí)間：2013-06-19
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IL-1a ELISA 試劑盒
用途：
人IL-1a ELISA 試劑盒用于體外定量檢測(cè)人血清、血漿、緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-1a。
本實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)天然的和重組的IL-1a。本試劑盒于研究，而非用于診斷。
試驗(yàn)原理：
IL-1a 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）?？笽L-1a 特異多克隆抗體包被微孔
板，已知IL-1a 濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣本、對(duì)照樣本和未知樣本加入微孔內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
先將IL-1a 抗原和生物素標(biāo)記的抗IL-1a 特異單克隆抗體同時(shí)孵育。洗滌后，加入親和素過(guò)
氧化物酶。再經(jīng)過(guò)孵育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入酶復(fù)合物的作用底物，產(chǎn)生顏色
反應(yīng)。顏色的深淺和樣本中IL-1a 的濃度呈比例關(guān)系。
提供的試劑和配制方法：
究，而非用于診斷。
| 試劑（2~8℃保存） | 數(shù)量 | 色標(biāo) | 配制 |
| 96 微孔板 | 1 | | 即用型 |
| 塑料蓋板 | 2 | | |
| 標(biāo)準(zhǔn)品：1000pg/ml | 2 支凍干粉 | 黃色 | 按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋 |
| 質(zhì)控 | 2 支凍干粉 | 銀色 | 按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋 |
| 標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液 | 1 支（25ml） | 黑色 | 10 倍濃縮液，用蒸餾水稀釋 |
| 人血清標(biāo)準(zhǔn)稀釋液 | 1 支（7ml） | 黑色 | 即用型 |
| 生物素標(biāo)記的抗IL-1a | 1 支（0.4ml） | 紅色 | 用生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋 |
| 生物素標(biāo)記抗體稀釋液 | 1 支（13ml） | 紅色 | 即用型 |
| 親和素HRP | 2 支（5ul） | | 0.5mlHRP 稀釋液預(yù)稀釋 |
| HRP 稀釋液 | 1 支（23ml） | 紅色 | 即用型 |
| 洗滌液 | 1 支（10ml） | 白色 | 200X， 用蒸餾水稀釋 |
| TMB | 1 支（11ml） | | 即用型 |
| 硫酸終止液 | 1 支（11ml） | 黑色 | 即用型 |
試驗(yàn)需要但未提供的用品：
?? 蒸餾水
?? 微量加樣器：10ul,50ul,100ul,200ul,1000ul
?? 旋渦振蕩器和磁力攪拌器
安全性：
?? 僅用于科研
?? 本試驗(yàn)所用的人血成分均經(jīng)檢測(cè)，不含有HbsAg 和抗HIV 陽(yáng)性物質(zhì)。盡管如此，無(wú)法
確保沒(méi)有傳播肝炎或艾滋病等的可能。因此處理這些血清、血漿樣本時(shí)，應(yīng)該遵守
有關(guān)的安全操作規(guī)程，例如CDC/NIH 健康手冊(cè)：“微生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)中的安全”
/1984。
→ 避免硫酸和TMB 與皮膚接觸。如有接觸，可用水*沖洗。
→ 不可在使用試劑盒的地方吃飯、飲水、吸煙或化妝。
→ 不可用口吸取樣本。
操作要點(diǎn)/試驗(yàn)室質(zhì)量控制：
1、 使用前應(yīng)根據(jù)標(biāo)簽上指示冷藏。使用時(shí)所有試劑應(yīng)平衡至室溫。凍干標(biāo)準(zhǔn)品使用后
應(yīng)丟棄。
2、 取出所需的孔條后，立即密封包裝，以防變質(zhì)。
3、 不用時(shí)所有試劑要加蓋封好。
4、 不同批號(hào)的試劑不可混用。
5、 過(guò)期的試劑不可再用。
6、 使用干凈的吸頭來(lái)吸取各種試劑、標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照或樣本，以防交叉污染。吸取硫酸
或底物溶液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。
7、 用干凈的塑料容器配備洗滌液。
8、 使用前用振蕩器*混勻各種試劑。
9、 微孔內(nèi)殘留液須充分吸干或在吸水紙上拍干，吸水紙不可插入孔內(nèi)吸水。
10、 TMB溶液是光敏的，避免長(zhǎng)時(shí)光照。避免與金屬接觸產(chǎn)生顏色反應(yīng)。
警告：TMB 有毒，避免手直接接觸，并妥當(dāng)處理。
11、 如配制后幾分鐘產(chǎn)生深蘭色，表明TMB 溶液被污染，必須棄去。在檢測(cè)完成
后一小時(shí)內(nèi)必須讀結(jié)果。
12、 吸取樣本時(shí)，按順序逐孔加樣，以確保孵育時(shí)間相同。
13、 孵育時(shí)間見操作規(guī)程。
14、 在洗滌微孔板之后15 分鐘內(nèi)加入TMB 溶液。
樣品收集，處理和保存
1、 細(xì)胞培養(yǎng)上清液——1000xg 離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
2、 血清——操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液
后，1000xg 離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
3、 血漿——EDTA，檸檬酸鹽和肝素血漿可用于檢測(cè)。1000Xg 離心30 分鐘去除顆粒。
4、 保存——如果樣品不直接使用，將其分為小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免
反復(fù)冷凍。如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的顆粒，檢測(cè)前
先離心或過(guò)濾。
注意：不要在37℃或56℃加熱解凍。在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑準(zhǔn)備：
1、標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液
蒸餾水10 倍稀釋。
2、標(biāo)準(zhǔn)品
對(duì)不同的待測(cè)樣品，此試劑盒提供兩種標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。因?yàn)樯镆后w可能含蛋白酶或
細(xì)胞因子結(jié)合蛋白，從而影響對(duì)待測(cè)細(xì)胞因子的識(shí)別。應(yīng)使用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀
釋標(biāo)準(zhǔn)品。
血清和血漿樣品使用人血清標(biāo)準(zhǔn)稀釋液稀釋；細(xì)胞培養(yǎng)上清液用標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液稀
釋。按標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行稀釋，稀釋后濃度為1000pg/ml IL-1a，可儲(chǔ)存。系列稀釋須在
每次檢測(cè)前準(zhǔn)備，稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品輕輕振蕩5 分鐘。
3、對(duì)照
對(duì)照也應(yīng)按樣品種類選擇相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。按標(biāo)簽要求以標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制。加樣
前輕輕振蕩對(duì)照5 分鐘。稀釋后不能儲(chǔ)存。
4、 生物素標(biāo)記的抗IL-1a 的稀釋
生物素標(biāo)記的抗IL-1a 用生物素標(biāo)記抗體稀釋液根據(jù)使用微孔數(shù)在干凈玻璃管中稀
釋。實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備。參見下表：
| 使用微孔數(shù) | 生物素標(biāo)記的抗體（ul） | 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（ul） |
| 16 | 40 | 1060 |
| 24 | 60 | 1590 |
| 32 | 80 | 2120 |
| 48 | 120 | 3180 |
| 96 | 240 | 6360 |
5、 親和素HRP 的稀釋
在含5ul 親和素HRP 的瓶?jī)?nèi)加入0.5ml HRP 稀釋液。本液為一次性使用。
根據(jù)使用微孔數(shù)在干凈玻璃管中進(jìn)一步稀釋。參見下表：
| 使用微孔數(shù) | 親和素HRP（ul） | HRP 稀釋液（ml） |
| 16 | 30 | 2 |
| 24 | 45 | 3 |
| 32 | 60 | 4 |
| 48 | 75 | 5 |
| 96 | 150 | 10 |
6、 洗滌緩沖液的稀釋
蒸餾水200 倍稀釋。
檢測(cè)方法：
1、 試劑用前充分混勻，避免產(chǎn)生泡沫。
2、 確定需要的微孔數(shù)，所有樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、空白和對(duì)照樣本均要做雙份。
3、 吸取200ul 標(biāo)準(zhǔn)品（見試劑的準(zhǔn)備）到A1, A2 孔，100ul 標(biāo)準(zhǔn)稀釋液到B1, B2, C1, C2,
D1,D2, E1,E2, F1, F2 孔（見下表）。從A1, A2 孔吸取100ul 到B1, B2 孔，用加樣器反
復(fù)吸排使其混合。小心不要擦到孔的內(nèi)表面。同樣從B1, B2 孔吸取100ul 到C1,C2；再
從C1,C2 到D1,D2 等，從zui后的兩個(gè)孔（F1, F2）中吸去100ul 不要。這樣從A1,A2
到F1,F2，IL-1a 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的濃度為1000pg/ml 到31.25pg/ml。也可在試管中進(jìn)行
此稀釋，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品直接加入反應(yīng)孔中。
4、 加100ul 配好的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液至空白孔G1,G2。
5、 加100ul 樣本至樣本孔和100ul 對(duì)照至對(duì)照孔H1,H2。
6、 蓋上微孔板，室溫下（18 至25℃）孵育2 小時(shí)。
7、 洗滌微孔板：① 吸去孔內(nèi)液
② 加0.3ml 洗滌液于各孔
③ 再吸去各孔內(nèi)液
④ 重復(fù)②和③二次
8、 配制生物素標(biāo)記的抗IL-1a。（配制見前述）
9、 加50ul 生物素標(biāo)記的抗IL-1a 稀釋液于所有孔內(nèi)。
10、 蓋上微孔板，室溫下（18 至25℃）孵育1 小時(shí)。
11、 洗滌微孔板。（見步驟7）
12、 僅在用前配制親和素HRP 液。（配制見前述）
13、 加100ul 親和素HRP 液于各孔，含空白孔。加蓋。
14、 室溫下孵育半小時(shí)。
15、 洗滌微孔板。（見步驟7）
16、 加100ulTMB 底物液至各孔。室溫下避光孵育15 至20 分鐘。
17、 通常根據(jù)ELISA 閱讀器確定孵育時(shí)間：許多ELISA 閱讀器僅讀數(shù)至2.0 O.D 值。
監(jiān)察O.D 值，應(yīng)在陽(yáng)性結(jié)果衰褪前終止反應(yīng)。（不超過(guò)20 分鐘）
18、 用100ul 硫酸加入各孔終止酶底物反應(yīng)。終止反應(yīng)后1 小時(shí)內(nèi)（這段時(shí)間在2 至
8℃避光保存）或加入硫酸后立即讀取結(jié)果。
19、 用分光光度儀讀數(shù)，450nm 作為初始波長(zhǎng)，620nm（可以用610 至650nm）作為
參考波長(zhǎng)。
建議微孔板編碼：
| | 標(biāo)準(zhǔn)濃度（pg/ml） | 樣本孔 | ||||||||||
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1000 | 1000 | | | | | | | | | | |
| B | 500 | 500 | | | | | | | | | | |
| C | 250 | 250 | | | | | | | | | | |
| D | 125 | 125 | | | | | | | | | | |
| E | 62.5 | 62.5 | | | | | | | | | | |
| F | 31.25 | 31.25 | | | | | | | | | | |
| G | 空白 | 空白 | | | | | | | | | | |
| H | 對(duì)照 | 對(duì)照 | | | | | | | | | | |
結(jié)果分析：
制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，平均光吸收值作Y 軸，對(duì)應(yīng)的IL-1a 濃度作X 軸。各樣本中的IL-1a 含
量根據(jù)樣本O.D 值通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定。
典型的mIL-1a 標(biāo)準(zhǔn)曲線（31.25-1000pg/ml）
本試驗(yàn)的局限性：
超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍（1000pg/ml）時(shí)，不可推測(cè)結(jié)果；樣本必須稀釋后再檢測(cè)。
本試驗(yàn)的檢測(cè)特性：
1、 敏感性：zui小檢測(cè)濃度低于10 pg/ml。
2、 準(zhǔn)確性：
| 批內(nèi) | 批間 | ||||||||
| 樣本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV% | 樣本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV % |
| A | 22 | 459.8 | 13.0 | 2.8 | A | 8 | 259.9 | 15.0 | 5.8 |
| B | 21 | 72.6 | 3.9 | 4.3 | B | 8 | 58.6 | 4.3 | 7.3 |
3、 稀釋度的線性：將含有1000pg/mL IL-1a 的人血清用標(biāo)準(zhǔn)稀釋緩沖液系列稀釋。樣本線
性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)為0.99。
4、 還原：人血清內(nèi)IL-1a 濃度（1000 至31.25pg/ml）的還原值為95.3%（91%至100%）。
檢測(cè)程序小結(jié)： 總時(shí)間 = 3 小時(shí)45 分鐘
加100ul 樣本或配好的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ?/div>
室溫孵育2 小時(shí)
洗3 次
加50ul 配好的生物素標(biāo)記的抗體于各孔內(nèi)
室溫孵育1 小時(shí)
洗3 次
加100ul 親和素-HRP 標(biāo)記物
室溫孵育半小時(shí)
洗3 次
加100ul TMB，避光，顯色12 至15 分鐘
加100ul 硫酸，終止反應(yīng)
在450nm 處讀取吸光度
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